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Hernán Cortés logra la derrota final de los mexicas con apoyo de aliados indígenas y de la Malinche, quien actuó como intérprete y consejera. Este triunfo permitió a los españoles planear nuevas expediciones hacia el occidente de México, donde esperaban encontrar riqueza, metales preciosos y rutas estratégicas para la Corona Española. La caída de Tenochtitlan abrió las puertas a la expansión del dominio hispano en toda Mesoamérica.
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Alonso de Ávalos recibió tierras al sur de Jalisco, que posteriormente se consolidaron como la Provincia de Ávalos, una de las primeras divisiones administrativas del occidente. Esta encomienda sirvió como base para futuras expediciones y asentamientos españoles en la región, y permitió la consolidación inicial del control colonial en Jalisco, preparando el terreno para la llegada de Nuño Beltrán de Guzmán.
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Nuño Beltrán de Guzmán, presidente de la Primera Audiencia de México, emprendió una expedición hacia el occidente con el objetivo de fundar una gobernación independiente de la Nueva España. Con 300 españoles y miles de indígenas aliados, avanzó por Michoacán y Jalisco en una de las campañas más violentas y destructivas de la conquista.
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Por orden de la emperatriz Isabel, en nombre de Carlos V, se estableció Santiago de Compostela como la capital de la Nueva Galicia, aunque había sido fundada bajo el nombre de "Villa del Espíritu de la Nueva Galicia" . Funcionó como sede administrativa de las conquistas de Guzmán, aunque con el tiempo perdió importancia frente al desarrollo de Guadalajara.
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Guzmán llegó a Tzintzuntzan, capital purépecha, donde fue recibido pacíficamente al inicio. Poco después enfrentó resistencia indígena, la cual sofocó con violencia. Este episodio consolidó su entrada en tierras del occidente y dio inicio a la conquista de territorios que más tarde conformarían la Nueva Galicia.
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Por órdenes de Nuño de Guzmán, el capitán Juan de Oñate fundó la Villa de Guadalajara en Nochistlán, Zacatecas. Sin embargo, la fuerte resistencia de los pueblos indígenas locales y la escasez de agua hicieron que el asentamiento fuera insostenible. Por estas razones, los colonizadores debieron abandonarlo y buscar un sitio más seguro para trasladar la ciudad.
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El segundo intento de establecer Guadalajara se llevó a cabo en Tonalá. Aunque en un inicio hubo mayor estabilidad, las tensiones con los habitantes locales y las condiciones del entorno hicieron inviable su permanencia, lo que llevó a otro traslado.
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El tercer asentamiento de Guadalajara se realizó en Tlacotán, donde permaneció durante algunos años. Fue más estable que los anteriores, pero la ciudad aún no alcanzaba las condiciones necesarias para convertirse en un centro urbano definitivo.
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Guzmán fue acusado de abusos, violencia y esclavización de indígenas. Fue sometido a un juicio de residencia y enviado a España, donde permaneció encarcelado durante varios años. Este proceso marcó el fin de su carrera política y de su influencia en la Nueva Galicia.
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Entre 1540 y 1542 ya cansados de los abusos, los pueblos caxcanes y otros grupos indígenas se rebelaron contra los españoles en una lucha que puso en jaque el control colonial. El virrey Antonio de Mendoza tuvo que intervenir para sofocar la rebelión. Aunque los españoles vencieron, la guerra evidenció la fuerza de los pueblos originarios frente a la conquista.
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La cuarta y última fundación de Guadalajara se hizo en el Valle de Atemajac bajo la dirección de Cristóbal de Oñate. Este sitio resultó seguro y fértil, lo que permitió que la ciudad se consolidara. Desde entonces, Guadalajara se convirtió en la capital más importante de la región y símbolo de la colonización española en el occidente.